Революционный микроскоп покажет скрытые механизмы жизни

Представьте, что вы пытаетесь разглядеть одну конкретную травинку в густом лесу. Именно такую задачу решают учёные, когда пытаются изучить крошечные белки внутри клетки. Но теперь у них появился инструмент, который может кардинально всё изменить.

Что случилось?

Физики из Калифорнийского университета в Беркли (University of California, Berkeley) создали устройство под названием лазерная фазовая пластина, которое значительно улучшает криоэлектронную микроскопию (крио-ЭМ). Этот метод уже произвёл революцию в изучении структур белков и ускорил разработку лекарств. Однако у него есть серьёзное ограничение: большинство человеческих белков слишком малы, чтобы получить их чёткие изображения. Новая лазерная технология поможет преодолеть это препятствие.

«Крио-ЭМ стал самым быстрорастущим методом определения структуры биологических макромолекул, а крио-ЭТ (криоэлектронная томография) должна показать, как эти молекулы работают вместе в естественном клеточном контексте, — говорит Holger Müller, профессор физики UC Berkeley и научный сотрудник Lawrence Berkeley National Laboratory, руководивший разработкой. — Но из-за ограничений соотношения сигнал/шум большинство человеческих и животных белков слишком малы, чтобы их можно было анализировать этими методами. Увеличение соотношения сигнал/шум, обеспечиваемое этой лазерной фазовой пластиной, как ожидается, преодолеет эти важные ограничения».

Как работает эта штука?

В основе прорыва лежит самый интенсивный в мире сфокусированный непрерывный лазер. Вместо простого освещения образца лазер взаимодействует непосредственно с электронным пучком микроскопа, изменяя его фазу для повышения контраста изображения. Это облегчает различение мелких молекул, включая гемоглобин, на фоне окружения. Также это может улучшить видимость структур внутри клеток, таких как ядро и митохондрии.

«С помощью крио-ЭТ мы смотрим на мелкий, очень сложный клеточный материал, который невероятно плотно упакован внутри клетки, — объясняет Bridget Carragher, технический директор по визуализации в Biohub (Редвуд-Сити, Калифорния). — Это как лес деревьев, и вы пытаетесь найти один лист на одном дереве. Крио-ЭТ нужен резкий скачок в контрасте, чтобы мы могли начать видеть, что происходит внутри клетки. Вот что обещает нам лазерная фазовая пластина».

При финансовой поддержке Biohub Мюллер приобрёл современный крио-ЭМ и оснастил его новой лазерной фазовой пластиной. Получившийся микроскоп он назвал Theia в честь древнегреческой титаниды, связанной со светом и сиянием. Тем временем Carragher руководит созданием аналогичного микроскопа в центре визуализации Biohub в Редвуд-Сити. В приборе её команды используются два лазера вместо одного, что основано на теоретических исследованиях Мюллера и его коллег. Два лазерных луча расположены под прямым углом друг к другу, и каждый работает примерно на половине мощности. Такая конфигурация помогает предотвратить выгорание компонентов и снижает оптические искажения, которые могут ухудшить качество изображения. Обе исследовательские группы сотрудничают с Thermo Fisher Scientific, ведущим производителем крио-ЭМ.

«Theia — это микроскоп Формулы-1, — говорит Мюллер. — У него дополнительная электронная оптика, которая даёт лучшее разрешение, чем у стандартного крио-ЭМ, даже без лазера. С добавлением лазерной фазовой пластины мы надеемся, что он действительно станет лучшим инструментом в мире».

Последние изображения и технические результаты команды из Беркли представлены в журнале Science. Детали двухлазерной конструкции Biohub доступны в недавно опубликованном препринте.

Как нобелевское открытие изменило микроскопию

Чтобы понять, почему новая технология важна, полезно вспомнить давнюю проблему биологической визуализации. Поскольку растительные и животные клетки в основном состоят из воды, они относительно прозрачны под обычным световым микроскопом. Эта прозрачность создаёт проблему: мелкие клеточные структуры рассеивают очень мало света и поэтому выглядят лишь немного темнее окружающего материала. Учёные традиционно решали это добавлением красителей, но окрашивание убивает клетки.

В 1930 году голландский физик Frits Zernike понял, что свет, проходя через биологический материал, меняется не только становясь ярче или тусклее. Когда свет рассеивается внутри клетки, он также испытывает крошечную задержку, которая меняет его фазу. Хотя человеческий глаз не может напрямую обнаружить этот сдвиг фазы, Zernike обнаружил, что его можно превратить в видимое различие в яркости. Сдвинув фазу нерассеянного света на 90 градусов, он сделал тонкие клеточные особенности более чёткими на фоне. Это нововведение стало основой фазово-контрастной микроскопии, за которую Zernike получил Нобелевскую премию по физике в 1953 году.

К началу 1940-х годов учёные уже признали полезность фазового контраста для изучения клеток. Они начали исследовать, можно ли ту же идею применить для улучшения электронных микроскопов, которые используют электроны вместо света для изучения структур размером с отдельные белки. К сожалению, ранние попытки столкнулись с серьёзными техническими трудностями. Устройства, предназначенные для изменения фазы электронных пучков, часто слишком ослабляли пучок, вносили нестабильность изображения или снижали разрешение. Возможное решение появилось в 2010 году, когда Мюллер и Robert Glaeser, ныне почётный профессор молекулярной и клеточной биологии UC Berkeley, предложили использовать интенсивный лазер для создания необходимого сдвига фазы. Их подход позволил улучшить контраст без ущерба для интенсивности электронного пучка.

Преодолевая ограничения электронной микроскопии

Glaeser сыграл важную роль в разработке крио-ЭМ, который предлагает потенциально более простой способ определения молекулярных структур, чем традиционная рентгеновская кристаллография. Рентгеновская кристаллография требует выращивания кристаллов изучаемых молекул и доступа к интенсивному источнику рентгеновских лучей. Крио-ЭМ избегает необходимости кристаллизации, но имеет свои трудности. Одна из главных проблем — электронный пучок может нагревать и в конечном итоге повреждать образец. Это ограничивает объём собираемой информации и детализацию изображений. Покрытие образцов металлом может уменьшить повреждения и улучшить контраст, но делает изображения менее чёткими.

В 1960-х годах исследователи начали изучать, может ли замораживание биологических образцов защитить их от радиационного повреждения. Glaeser продемонстрировал, что охлаждение образцов помогает сохранить их во время визуализации. Он также предложил использовать менее интенсивный электронный пучок для изучения тысяч замороженных молекул одновременно, что ещё больше снижает повреждения. Поскольку молекулы будут расположены под разными углами, компьютеры могут анализировать и объединять их изображения для восстановления высокодетализированной молекулярной структуры. Эти достижения заложили основы современной крио-ЭМ, разработчики которой получили Нобелевскую премию по химии в 2017 году. В своих благодарственных речах нобелевские лауреаты отметили вклад Glaeser. Нобелевский комитет похвалил технологию, объяснив, что крио-ЭМ «упрощает и улучшает визуализацию биомолекул. Этот метод перевёл биохимию в новую эру».

15-летний путь к созданию исключительно мощного лазера

Превращение концепции лазерной фазовой пластины в работающую технологию потребовало многих лет инженерии. После предложения 2010 года Мюллер потратил 15 лет на реализацию идеи, часть исследований поддерживалась Национальными институтами здравоохранения (NIH). Первой серьёзной задачей было создание чрезвычайно интенсивного лазерного луча, сконцентрированного на крошечной площади. Исследователям нужна была достаточная интенсивность света, чтобы изменить фазу электронного пучка на 90 градусов. На разработку необходимой системы ушло десятилетие. Решением стало заключение непрерывного лазерного луча в сферическую камеру, выложенную зеркалами. Поскольку свет многократно отражается внутри полости более 10 000 раз, его интенсивность резко возрастает, а луч фокусируется в чрезвычайно маленькое пятно.

«Это 75 киловатт, сфокусированные до нескольких микрон, — говорит Мюллер. — Это мощнее, чем используется для сварки. Это мощнее военного лазера. Это создаёт самый яркий непрерывный лазерный фокус из когда-либо созданных».

Команда сначала продемонстрировала работоспособность концепции, установив лазерную фазовую пластину в один из старых электронных микроскопов Glaeser. Дополнительное финансирование от Biohub затем позволило приобрести customized, современный крио-ЭМ Thermo Fisher Krios и модифицировать его для размещения лазерной технологии. В своём последнем исследовании учёные протестировали модернизированный микроскоп на шести различных образцах, различающихся по размеру и методу подготовки. Лазер неизменно улучшал разрешение изображения, с особенно важными gains для образцов, которые трудно визуализировать стандартными методами.

«Для самых сложных случаев — мелких частиц, плохих образцов — лазер даёт очень значительное преимущество», — говорит Мюллер.

Более чёткие изображения белков, которые раньше были слишком малы

Чтобы продемонстрировать возможности нового микроскопа, исследователи восстановили изображения двух разных белков. Первым был альдолаза — белок, обнаруженный в мышцах, который современные крио-ЭМ системы уже могут относительно легко визуализировать. Вторым был гемоглобин — белок, отвечающий за перенос кислорода через кровоток. Гемоглобин гораздо меньше и находится near нижнего предела размера белков, которые обычные крио-ЭМ приборы могут надёжно анализировать. Используя лазерную фазовую пластину, исследователи улучшили разрешение обеих белковых структур. Улучшение было особенно заметным для гемоглобина, подчёркивая потенциал технологии для преодоления трудностей, связанных с малыми молекулами.

«Суть в том, что если у вас большой белок и действительно хороший образец — свежий или замороженный без пузырьков, например, — вам может не понадобиться фазовая пластина, чтобы получить одно качественное изображение. Но для маленького белка и плохого образца лучше всего работает лазер, — говорит Мюллер. — Это может заполнить огромный пробел в наших знаниях о структурах белков, которые не могут быть кристаллизованы или слишком малы для сегодняшней крио-ЭМ. И это будет революцией для крио-ЭТ».

Масса белка обычно выражается в дальтонах — единице, названной в честь английского химика John Dalton. Один дальтон определяется как одна двенадцатая массы атома углерода-12. Обычная крио-ЭМ с трудом визуализирует белки меньше примерно 70 килодальтон. Это ограничение особенно значимо, потому что белки ниже этого порога составляют около 90% протеома человека — полного набора белков, производимых организмом. С лазерной фазовой пластиной исследователи теперь могут визуализировать белки размером до 50 килодальтон, хотя это остаётся сложной задачей. Такие белки ещё меньше гемоглобина.

Следующая цель — ещё меньшие белки

Мюллер считает, что технология в конечном итоге позволит учёным изучать белки размером до 17 килодальтон (размер белка миоглобина). Для достижения этой цели может потребоваться ещё одно улучшение: использование остро сфокусированного электронного пучка вместо расфокусированного, который сейчас необходим для создания достаточного контраста без лазерной фазовой пластины. По словам Мюллера, лазерная система должна позволить получать контраст непосредственно от изменений фазы в сфокусированном электронном пучке. В случае успеха эта корректировка может снова удвоить контраст и соотношение сигнал/шум, добавив к улучшению, уже достигнутому с помощью лазерной фазовой пластины. Такой прогресс может сделать возможным изучение гораздо большей доли белков организма и обеспечить беспрецедентное понимание того, как они взаимодействуют в сложной среде клеток.

«Эта технология — ступенчатое изменение для биологии, — говорит Stephani Otte, вице-президент Biohub по наукам о визуализации. — Мы сможем впервые увидеть, как молекулярные машины работают внутри живой клетки, в контексте. То, что когда-то было невидимым, станет видимым — и это меняет всё в нашем понимании болезней».

В исследовательскую группу из Беркли также входят Glaeser; постдоки и со-первые авторы Petar Petrov и Jessie Zhang; штатный учёный Jonathan Remis; постдок Hang Cheng; а также нынешние и бывшие аспиранты-физики Jeremy Axelrod, Eric Cooper, Ian Hicklin, Shahar Sandhaus и Cooper Schnurr. В Biohub Carragher и David Agard, научный директор-основатель организации по визуализации, совместно руководят группой динамической структурной клеточной биологии. Оба являются со-корреспондирующими авторами препринта Biohub вместе с инженером Biohub Pavel Olshin.

Что это значит для нас?

Этот прорыв может показаться далёким от повседневной жизни, но на самом деле он имеет огромное значение. Представьте, что врачи смогут видеть, как работают мельчайшие молекулы внутри наших клеток — те, которые связаны с болезнями. Это как перейти от карты с крупными городами к карте с каждой улицей и домом. Понимание того, как взаимодействуют белки, поможет создавать более эффективные лекарства и лучше диагностировать заболевания. Возможно, в будущем лечение станет более точным и индивидуальным. Так что наука продолжает делать невидимое видимым — и это меняет всё.